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重组DNA的制备及在大肠杆菌内的表达重组DNA的制备及在大肠杆菌内的表达

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基因在大肠杆菌 大肠杆菌表达 DNA 大肠杆菌的 基因在大肠杆菌内表达 基因与 的DNA 在大肠杆菌 基因表达 与大肠杆菌的DNA 基因重组 及在大肠杆菌 的表达 及在大肠杆菌的表达 制备重组 大肠杆菌的DNA
资源描述:
重组DNA的制备及在大肠杆菌内的表达姜丽丽(07生物科学)0725403011摘要(Abstract)本实验的目的主要是从细菌基因组中获得目的基因,构建表达载体并在大肠杆菌中表达,同时对表达产物进行SDS-PAGE分析。实验中主要进行的操作:提取基因组DNA,进行琼脂糖电泳,检查结果后用PCR方法进行扩增,扩增后进行核酸的分离纯化及回收,然后制备感受态细胞,然后在体外重组连接,经鉴定重组片段为目的片段后进行SDS-PAGE电泳,检查蛋白是否表达。实验中提取基因组DNA及PCR基因扩增和回收成功,感受态细胞的制备及体外重组连接成功,但最终目的片段在大肠杆菌中未得到表达。按照理论目片段可以在大肠杆菌体内表达,但实验过程中要特别小心,要避免各种污染,一点污染或一个 的大 最终的结果 。(Intorduction)DNA 结构的提 , 分 生物学时 .分 生物学 生物大分 的 进 一个 的 段,的 到分 ,"生 ¡¢"£⁄ ,¥ƒ§currency1' “ «‹的构成和 ›的fifl.在以后的 50–†,分 学,分 免‡学,细胞生物学· 学科 ¶后•‚„ ”,一个»一个生 的…‰从分 ¿得到 §`的´ˆ,DNA重组˜¯ 是为˘用生物˙程¨段的 和 用 ˚ ¸ 的˝˛.重组DNA˜¯可以提取可用ˇ基因— 的基因˙程细胞,进一 “基因 制和 分 基理, 对ˇ¥ 学的 重要 。本实验 过在体外 核酸片段Æ ª 连接, 成重组DNA,然后 大肠杆菌细胞内进行表达,获取目的片段表达的蛋白 。 个实验可以 用ˇ制备 体,获取— 的蛋白并可以扩增,可获得Ł大的经ØŒº。ª 大肠杆菌 DNA重组 琼脂糖 PCR 核酸 电泳 目的片段 感受态细胞 蛋白 基因扩增 æ基 菌 生 ı 制ł内øœ 离心 ß菌 œø。Æ实验过程准备菌种E.Coli.BL21 含 ªpET32的E.Coli.DH5a及E.Coli.DH5a,˙ œ:T4连接œ 制ł内øœSacI XbaI TaqœPCR 物:Primer1(上链):5'- ATCTCTAGAATGGAATCCCTGACG-3'Primer2(下链):5'- GTTGAGCTCTCAGGCTGCTTG-3'其他化学试剂:TEı ,10%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS),20mg/ml蛋白œK,5mol/L NaCl溶 ,CTAB/ NaCl溶 ,24:1氯仿/异戊醇,25:24:1酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇,LBæ 基,Amp 生 ,溶I,溶 II,溶 III,酚氯仿(25:24:1),无水酒精,TE(pH8.0),0.1mol/L的CaCl2,甘油,ß菌三蒸水,3mol/LNaAc(pH5.2),1.5mol/LTris(pH8.0),1.0mol/LTris(pH 6.8),30%丙烯酰胺,10%SDS,10%过硫酸铵,TEMED,考马斯亮蓝R250染 ,洗脱 ,Tris-甘氨酸电泳ı ,TAE电泳ı ,2xSDS凝胶加样ı ,考马斯亮蓝 R250染色 ,脱色 ,纯化琼脂粉,EB染 以及凝胶回收试剂盒。实验 冷冻离心 ,摇床,恒温æ 箱,制冰 ,-70℃冰箱,恒温水浴锅,高压ß菌锅, 涡混合 ,精密数显酸¿计,紫外分析 ,凝胶分析 ,超净台,电泳 ,垂直板电泳槽及梳 ,水平板电泳槽及梳 ,PCR ,移 枪及枪头,微量注射 ,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰 。实验方法1 实验准备① 大肠杆菌在æ 基平板上划线。②配置 期需要的溶 LB 体æ 基:每升含胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g。用NaOH pH至7.5,总一升,分400mL 来,分装ˇ10多个试管中(每个试管中约5mL),及多个锥 瓶中(每个锥 瓶中约50mL),作为 体æ 基,ß菌待用。LB固体æ 基:在上述剩余的600mL 体æ 基中加 1.5%的琼脂,ˇ电炉上溶“,分装在数个锥 瓶中(每个锥 瓶中约50mL),为固体æ 基,ß菌待用。溶 Ⅰ:50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0),高压ß菌15 分钟,储存ˇ4℃冰箱。 溶 Ⅱ:0.4 mol/L NaOH (临用˝用10mol/L NaOH 母 稀释),2% SDS。 用˝·体 混 。溶 :5 mol/L KAc 60ml,冰 酸11.5ml, H2O 28.5ml,定 至100ml, 并高压ß菌。10xTE ı :10 mmo/L Tris-Cl (pH8.0),1 mmol/L EDTA (pH8.0),高压ß菌后储存ˇ4℃冰箱中。0.1mol/L CaCl2溶 : 取1.11g CaCl2(无水,分析纯),溶ˇ80ml重蒸水中,定 至100ml,高压ß菌。多备 瓶无菌水。装æ 基的锥 瓶 试管 试剂瓶的瓶 分别用 , 移 枪的枪头 1.5mL离心管 0.5mL离心管 用盒 装 , , 高压蒸 ß菌锅中ß菌。待各试剂瓶 æ 基·冷 后......IPTG (200ug ):在800μl蒸 水中溶“200 IPTG后,用蒸 水定 至 ,用0.22 的 过 菌,分装在EP管中, 存ˇ 20℃冰箱中。数小时后从 菌¡的æ 基上用 ¢菌种接 ß菌冷 后£⁄试管æ 基中,摇瓶进行扩大æ 。¥外,用 ¢菌种在æ 基平板上划线,置æ 箱中过ƒ。用接种 在菌 中¢§量菌 在æ 基平板上划线,置ˇ摇床中过ƒæ 。2 细菌基因组DNA的小量制备1currency1 细菌æ 至'和“态,取1.5ml的æ 物12000rpm离心15min,平行«‹管›2. TEı 稀释成0.1x的,取10μl的10xTE溶ˇ990ul的无菌水中›3currency1fifl物加 570μl 的TEı ,用 管–†‡⁄ ¡重·。加 30μl 10%的SDS和3μl 20mg/ml的蛋白œK,混 ,ˇ37℃温 1h›4currency1加 100μl 5 mol/L NaCl,¶分混 ,•加 80μl CTAB/ NaCl溶 ,混 ,ˇ65℃温 10min›5currency1加 ·体 (约750μl)的氯仿异戊醇,混 ,12000rpm离心4min。 上§ ‚ 一个 管中›6currency1加 ·体 (约600μl)的酚/氯仿/异戊醇,混 ,12000rpm离心5min, 上§‚ 一„ 管中›7currency1加 0.6体 (约300μl)异丙醇,””混合直到DNAfifl下来 ,离心»上§,用 70%乙醇中洗…›8currency112000rpm离心5min,‰上§, 然¿ ,重溶ˇ30μl 的0.1xTEı 。¨13. 0.8%琼脂糖凝胶的制备1currency1 取1g琼脂糖,置ˇ小三 瓶中,加 100ml 1 x TAE稀释ı ,微 炉加˚至琼脂糖¸ ˝化,取三 瓶,””摇 ›(取20mL50xTAEı 稀释至1000mL1xTAEı ,其中100mL制胶,其余900mL作为ı )2currency1用胶˛ 凝胶槽ˇ — ,置˙作台 上, 梳 在槽的 槽内›3currency1在˝化的胶 中加 1.5uL1%的EB并 ¡混 ,小心' 胶 (约300ml剩下的700ml存 ˇ冰箱中) 凝胶槽内, ¡ı ' 直至 成约3mm 的胶 , 置20分钟›4currency1待琼脂糖凝胶 凝固后, ¨ 用 ”” 梳 ›5currency1取下— 胶˛, 凝胶连同槽 电泳槽平台, TAE稀释ı 过凝胶 2mm Æ。6currency1加样:用移 枪 9ul样˜ Æ1.5ul6xloading buffer上样ı 按6:1混合后,分别加 胶板的加样 内。ª一个 加Marker,其余 加 6个样˜7currency1电泳:样˜ 连接 ,¥一 连接Ł ,接 电Ø, 电泳。8currency1Œº和 照:小心'取 凝胶槽,在 254nm紫外 下进行Œº。DNA存在的 置 ” æ色 。 ı可Œº到§`的 ˛。用在凝胶电泳成 照。 4.PCR基因扩增(1)在0.5ml Eppendorf管中加 :
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bannbann上传于2015-04-19

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